作为分子生物学中心法则的关键一环，RNA不仅直接参与蛋白质合成，更在转录及转录后水平精确调控基因表达。除了序列本身，RNA分子的时空分布与其功能及调控机制息息相关，对解析细胞功能和工作模式至关重要。由于细胞内同一基因会转录出多个RNA拷贝，且每个拷贝因所处位置及相互作用分子的差异而呈现出高度的异质性，因此开发具备单分子分辨率的活细胞成像方法，以观察各个内源RNA分子的动态活动，已成为领域内的迫切需求。
然而，现有的成像技术面临显著瓶颈：传统的MS2重复序列标记RNA，虽能实现单分子追踪，但外源序列的引入极易干扰RNA的天然生理状态。而此前基于CRISPR的成像技术或荧光分子信标（Molecular Beacons）虽能标记内源RNA，但往往局限于重复序列或RNA聚集体，单分子追踪分辨率不足等缺陷长期制约着该领域的研究进展。截至目前，在单分子分辨率下标记并追踪非重复序列的内源性RNA运动仍是一项巨大挑战。
由尚思神经科学中心夏程龙助理教授领衔开发的 smLiveFISH 技术，巧妙利用了 RNA 靶向 CRISPR-Csm 系统集 crRNA 阵列剪切与天然信号放大特性于一体的优势。通过设计24-48个靶向RNA的探针阵列，配合每个复合体携带≥3个GFP标签的多荧光标记Csm蛋白，该技术成功突破了传统成像信噪比不足的瓶颈，首次直接在单分子水平观测到内源性RNA在活细胞中的动态运动。
研究团队利用该技术不仅验证了NOTCH2 mRNA通过共翻译转运锚定在内质网的经典理论，还通过药物阻断翻译直接观测到了其运动模式的变化。同时，通过对MAP1B RNA的实时观测，团队直接捕捉到了该mRNA沿微管定向运输的画面，为MAP1B在细胞边缘富集的现象提供了直观的机理解释。此外，研究发现当用嘌呤霉素抑制翻译时，MAP1B mRNA会聚集成与P小体共定位的应激颗粒。这一发现揭示了RNA代谢与细胞应激反应的深度关联，为未来在高精度单分子层面评估药物动力学、提升新药研发与精准医疗效率提供了可能。
通过对内源 RNA 运动规律的深入追踪，smLiveFISH 技术在揭示复杂生命现象方面展现出巨大潜力，尤其在神经科学与 RNA 细胞生物学领域应用前景广阔。该技术对RNA 运动与步进位移的高灵敏度监测，使未来深入解析 FXS、ALS 等疾病中的 RNA 分布异常并获取核心动态病理证据成为可能。此外，随着正交性 III 型 CRISPR-Cas 系统的进一步开发，未来有望实现多色实时成像，从而深入探讨 RNA-RNA 相互作用、剪接及共翻译复合体组装等前沿课题。这一系列突破将全面加速 RNA 时空动力学研究，为精准医疗与新药研发提供高精度的单分子评估平台。
该工作发表于《Nature Biotechnology》，被《Nature Method》 (https://www.nature.com/articles/s41592-025-02672-9) 、《Nature Biotechnology》(https://www.nature.com/articles/s41587-025-02560-9) 等知名杂志报道。第一作者为复旦大学尚思神经科学中心夏程龙助理教授。夏程龙课题组将长期致力于生物大分子成像技术、空间转录组学技术及基因编辑工具的开发与应用，欢迎对这些方向感兴趣的科学家们联系探讨。
原文链接：Single-molecule live-cell RNA imaging with CRISPR–Csm | Nature Biotechnology
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